Université de Liège - Centre de l'Oxygène, Recherche et Développement (CORD)

L'Oxygène et la Vie: Tome II - L'Oxygène en Pathologie des Mammifères

Mitochondries et métabolisme de l'oxygène

Première partie: Mitochondries et oxygénation

Carol Deby

Chapitre IV : Phénomènes redox mitochondriaux

Les cellules et les tissus doivent maintenir un environnement réducteur pour survivre.
Schafer et Buettner, 2003

1. Généralités

L'énergie nécessaire à la vie est fournie par un flux continu d'électrons entre des métabolites oxydables (capables de perdre des électrons) et l'oxygène diatomique, but ultime de leur déplacement.
Ces électrons sont porteurs d'une énergie dont la valeur est donnée par la mesure de la différence de potentiel entre la molécule porteuse de l'électron (état réduit) et la même après le départ de l'e^- (état oxydé), mesurée en millivolts. La mesure effectuée par voltmètre enregistreur montre une courbe sigmoïde ; le potentiel médian (mid-potential) passe par le point d'inflexion de la courbe.

L’ETC comprend ainsi des étapes caractérisées par des couples réduits/oxydés présentant des midpotentials de moins en moins négatifs (ou de plus en plus positifs). La croissance de la valeur algébrique du potentiel électrique correspond, comme nous le verrons, à une libération d'énergie exprimable en électron-volts, mais aussi en Joules ou en kCalories.
Le flux d'électrons s'opère grâce à l'existence de cascades de couples redox dans les cellules dont le potentiel, très négatif au début de la cascade, devient progressivement positif.
Mais les agents chimiques qui permettent les oxydations sont des formes activées de l’O₂ (ROS ou reactive oxygen species) (voir Nordberg et Arner, 2001 ; Schafer et Buettner, 2003).

A. Quelques définitions

• Etat redox
Il y a un quart de siècle, il était question du potentiel redox cellulaire, puis d'état redox. Depuis les travaux de Schafer et Buettner, en 2001, l'expression "état redox" s'applique à un couple redox précis qui est défini :
1) par son potentiel médian (midpotential) appelé aussi demi-potentiel d'électrode (half-potential), mesuré dans les conditions standards (molarité : 1; pression : 1 atmosphère; température : 25°C; pH 0),
2) par sa capacité réductrice.

• Environnement redox
C'est la sommation, pour plusieurs couples, des produits des états redox par les capacités réductrices.
L'environnement redox cellulaire est un facteur métabolique essentiel pour diverses fonctions cellulaires. Il est assuré principalement par la balance entre les formes réduites de fonctions thiols -SH et leurs formes oxydées -S-S-(disulfures).
C’est le couple GS-SG / 2G-SH qui est le principal responsable de cette force réductrice (Schafer et Buettner, 2001).

B. Principaux couples redox mitochondriaux 

GSSG/2 GSH
NAD⁺/NADH
NADP⁺/NADPH
CoQ/CoQ^•

C. Mesures de l’état redox

1. L'équation de Nernst

Elle est à la base de tout calcul de l'état redox.

.

Dans la figure IV-2, nous envisageons une réaction d'oxydo-réduction :
un donneur d'électron D, à l'état réduit puisque accusant un surplus d'électrons, donne un ou des électrons à un accepteur A, forcément oxydé puisqu'il est en déficit d'électrons.
Le donneur D passera à l'état oxydé par sa perte d'e^- tandis que l'accepteur sera réduit par son gain d’e^-.
Comme dans les processus vitaux les conditions sont variables, non standardisables, on a recours à une transformée de l’équation de Nernst.

2. Voltage d'une cellule électrochimique

Il est défini en partant de la loi de Gibbs de changement d'énergie ΔG, qui est valable seulement pour des conditions bien standardisées:

                                   ΔG^0’ =  - nFΔE₀ (1)

            n : nombre d'électrons mis en jeu
            F : constante de Faraday
            ΔE₀ : potentiel de demi-réaction mesuré dans les conditions standards.

Rappelons que si ΔG^0’ est négatif, la réaction est exothermique (libère de l’énergie) et que si ΔG^0’ est positif, la réaction est endothermique (requiert de l’énergie).

D. Calcul de l’énergie libérée lors de la réduction d’un atome d’oxygène

Considérons la « demi-réaction » de réduction de l’oxygène en présence de protons

      2H⁺ + 1/2 O₂  ⇒ H₂O  (2)

Cette « demi réaction »  O₂/ H₂O présente un potentiel  E₀’= 0,816 V.

Elle peut être comparée à la réaction d’oxydo-réduction de départ au niveau du CoI de l’ETC:
   NAD⁺/NADH, pour laquelle   E₀’= – 0,32 V.
En comparant le potentiel de la réaction finale à celui de la réaction initiale, on trouve une variation
   ΔE₀’= 0,816 – (-0,32) = 1,14 V

En appliquant la formule (1) et en donnant aux facteurs variables les valeurs suivantes :
            n = 2 ; ΔE₀ = 1,14
            ΔG^0’= – (2 x 96,5 x 1,14) = –220 kJ/mole = –52,6 kCal/mole (pour rappel : 1 Calorie = 4,18 Joules)

In vivo, les résultats sont un peu différents.
Il est intéressant de savoir que l’énergie requise pour la formation d’ATP est de 51,8 kJ/mole (12,39 kCal/mole).
L’énergie libérée par la demi-réaction (2) est considérable et conduirait le milieu où elle se passe à la combustion (réaction directe de l’oxygène avec une matière combustible) si l’énergie apportée par les électrons n’était pas préalablement affaiblie. Dans la nature, c’est par petites quantités qu’est dissipée cette énergie qui pourrait être explosive. Les électrons deviennent de moins en moins énergétiques.

2. Intervention des espèces activées de l'oxygène (ROS)

Les ROS (Reactive Oxygen Species) jouent un rôle physiologique très spécifique dans la production de signaux intervenant dans le potentiel redox cellulaire (Fleury et al., 2002 ; Ueda et al., 2002). Ce sujet est traité dans le chapitre VI.

3. Bref aperçu sur les molécules thiolées et séléniées

Elles réalisent des systèmes régulateurs du potentiel redox

Importance du glutathion et des molécules à thiols et sélénium : voir Björnstedt et al., 1997 ; Schafer et Buettner, 2001 ; Boosalis, 2008).

Le glutathion est le thiol le plus abondant dans les cellules, atteignant des concentrations proches de 10mM (Meister, 1994; Moriarty-Craige et Jones, 2004).

Les molécules porteuses de fonction -SH (résidus cystéynyls), depuis le glutathion, un tripeptide, jusqu'aux polypeptides et protéines, interviennent de manière capitale dans le maintien du potentiel redox dans des intervalles réducteurs compatibles avec la survie. Ils participent aux systèmes "antioxydants" en subissant une série de modifications par oxydation par les dérivés de l'oxygène activé (Berndt et al., 2007).
Dans la série de réactions suivantes, "ROS" (Reactive Oxygen Species) symbolise divers dérivés activés de l'oxygène moléculaire.

         P-SH  + HS-P  ⇒  P-S-S-P  (P: chaîne polypeptidique ou protéine)
        
         P-SH  + HS-G  ⇒  P-S-S-G  (G : glutathion)

         P-SH  + ROS   ⇒  P-SOH (acide sulfénique )

         P-SH  + ROS   ⇒  P-SO-OH (acide sulfinique )

         P-SH  + ROS   ⇒  P-SO₃-H (acide sulfonique )

Ces résidus cystéinyls sont contrôlés par le système des thiorédoxines et celui des glutarédoxines (Berndt et al., 2007).

A. Le glutathion

Le glutathion représente la majeure partie des thiols de faible poids moléculaire impliqués dans l'homéostasie redox des cellules de mammifères et joue un rôle central dans la défense cellulaire (Biswasa et al, 2006). Le glutathion mitochondrial, à lui seul, constitue une partie importante de la réserve cellulaire de GSH : de 10 à 15 % du glutathion total du foie (Garcia-Ruiz et al., 1994) et des tubules rénaux proximaux (Schnellmann et al., 1988).

L'équilibre glutathion réduit/glutathion oxydé mitochondrial

Les mitochondries importent le GSH du cytosol et stockent près de 15 % du contenu cellulaire total en GSH (Meister et Anderson, 1983 ; Schafer et Buettner, 2001).
La régénération de la forme GSH est au centre de la régulation du potentiel redox de la mitochondrie (Aon et al., 2007). La figure IV-5 montre les étroites relations existant entre ce processus et les cycles de régénération du NADPH et du NADH et le rôle joué par la transhydrogénase (Hoek et Rydström, 1988 ; Jackson, 2003 ; Rydström, 2006).

Fig. IV-5 : Interdépendance des couples redox par des réactions enzymatiques de régénération.

B. Les thiorédoxines (Trx)

Les thiorédoxines Trx sont des enzymes à activité antioxydante intrinsèque comme toutes les protéines à groupement thiol (-SH) (Nordberg et Arner, 2001; Chen Y et al., 2002). Elles jouent aussi un rôle important dans la régulation du système immunitaire. Une fois oxydée, la thiorédoxine est réduite par la thiorédoxine réductase (TrxR) (voir ci-dessous). C'est en 1964 que fut isolée la première Trx. Ce sont des petites protéines de 12kDa, présentant un site actif dithiolé (Holmgren, 1976; Watson et al., 2004), qui font partie d'un système antioxydant dont les premiers membres connus sont le glutathion (G-SH) et la glutathion peroxydase.
Le site actif de la Trx réduite est formé de deux cystéines et de deux autres résidus :

                                   - Cys32-Gly-Pro-Cys35-Lys-

Les deux résidus cystéinyls oxydés (inactifs) peuvent être réduits par une flavoenzyme, la thiorédoxine réductase (TrxR), en présence de NADPH (Zhou et al., 2007).
Les 2 thiols de la séquence de la Trx peuvent réduire un pont disulfure sur une autre molécule (Hashemy et al., 2007).

Les thiorédoxines  protègent aussi la cellule contre les agents électrophiles (Watson et al., 2004).
Les cellules de mammifères contiennent deux espèces de Trx ; Trx1 est présente dans le cytosol tandis que Trx2 est localisée dans les mitochondries (Vlamis-Gardikas et Holmgren, 2002).
Les Trxs sont des donneurs d'électrons pour des enzymes porteuses de deux fonctions thiols pouvant former un pont disulfure, telles que les peroxyrédoxines (Rhee et al., 2005).
La thiorédoxine-2 mitochondriale a pu être clonée à partir du DNA mitochondrial du muscle cardiaque (Spyrou et al., 1997), du foie (Damdimopoulos et al., 2002), des cellules-souches (Chen Y et al., 2002) et du placenta (Ejima et al., 1999a et 1999b).

C. Les thiorédoxine réductases (TrxR)

Les thiorédoxine réductases (TrxR) sont des enzymes possédant un groupement sélénocystéine dans leur site actif. Les TrxR interviennent aussi dans la dégradation des peroxydes lipidiques et du peroxyde d’hydrogène et dans la régénération du radical ascorbyle en acide ascorbique.

Les deux thiorédoxine réductases des mammifères, TrxR-1 et TrxR-2, sont des enzymes à FAD, homodimériques (54-58 kDa), à sélénocystéine (Fang et al., 2005), et dont les deux composants ont chacun un site catalytique identique. Elles catalysent la réduction par le NADPH du disulfure des thiorédoxines oxydées. Elles sont inhibées par la curcumine (Fang et al., 2005). En coopération avec les thiorédoxines, elles contribuent à la régulation des potentiels redox cytosolique et mitochondrial (Gromer et al., 2003).

Chez les mammifères, le site actif se trouve sur la partie C terminale et consiste en un tétrapeptide :

                      (Sec: résidu de la sélénocystéine).

Par cette particularité, les TrxR présentent de grandes analogies avec la GSH peroxydase qui possède le même site actif en position C terminale (Gladyshev et al.,, 1996; Tamura et al., 1996; Zhong et al., 1998). Cette position du site, plus accessible, élargit la spécificité de ces enzymes.
La forme oxydée de la TrxR (TrxRox) est constituée par un pont mixte entre la cystéine et la sélénocystéine. La TrxRox est réduite d'abord au niveau du FAD par le NADPH; les 2 électrons et les 2 protons sont ensuite transférés sur le site actif oxydé, rompant le pont Se-S et reformant un sélénol et un thiol (Cenas et al., 2004). Dès lors, le site est apte à réduire non seulement une molécule de Trx, mais aussi d'acide lipoïque oxydé ou des quinones (Cenas et al., 2004); elle peut réduire le peroxyde d'hydrogène (Zhong et Holmgren, 2000), mais aussi les lipoperoxydes (Björnstedt et al., 1995) ; elle permet le recyclage de l'acide ascorbique (May et al., 1998 et 2004).

D. Le système des thiorédoxines

Couplées aux thiorédoxine réductases, les Trx constituent un système clé de la régulation de l'environnement redox. Transférant des électrons donnés par les molécules de NADPH, la TrxR réduit la Trx correspondante qui peut alors réduire à son tour les protéines redox.

Fig. IV-7 : Système thiorédoxine-thiorédoxine réductase.
Encadrée en rouge, la TrxR avec en vert le site réduit et en bleu, le même site oxydé.
TRX : thiorédoxine oxydée; TRX : thiorédoxine réduite.

Ce système assume un grand nombre de fonctions. De lui dépendent notamment les peroxyrédoxines (voir plus bas).

E. Les glutarédoxines (Grx)

Les glutarédoxines sont des oxydoréductases dépendant du GSH. Ce sont des petites protéines à fer et à soufre dont le site actif est le suivant :
                           -Cys-Pro-Tyr-Cys- 
                  .
La Grx-2 (mitochondrial thioltransferase), découverte en 2001 par Gladyshev et al., est mitochondriale et pèse 18 kDa (Fernando et al., 2006). Elle est synthétisée dans le cytosol, puis dirigée soit vers le noyau, soit vers les mitochondries. Elle contrôle la balance redox.
Deux molécules de Grx sont réunies par un cluster 2Fe-2S coordonné par 4 résidus cystéine, pour former un dimère inactif, l’hologlutarédoxine (Lillig et al., 2005; Johansson et al., 2007).

Fig. IV-8 : Cluster à 2 Fe et 2S de l’hologlutarédoxine.

Par déséquilibre du rapport G-SH/G-S-S-G, le potentiel redox devient plus oxydant, casse la liaison assurée par le cluster 2Fe-2S et les deux monomères deviennent actifs.

Les Grx peuvent accepter des électrons de deux donneurs (Johansson et al., 2004 ; Fernando et al., 2006), créant ainsi deux voies (voir figure IV-9) :
                       - celle du GSH
                       - celle de la Trx
La Grx-2 a des fonctions encore mal connues, mais elle réduit H₂O₂ et les hydroperoxydes organiques en utilisant GSH comme co-facteur (Fernando et al., 2006).

La Grx-2 mitochondriale catalyse très efficacement la déglutathionylation (Johansson et al., 2004), notamment au niveau du complexe I, principale source de ROS dans les mitochondries, régulant ainsi la production d'anion superoxyde par CoI (Beer et al., 2004 ;Taylor et al., 2003).
La réduction de Grx-2ox est assumée par le GSH, mais aussi par la TrxR (Johansson et al., 2004).

F. La peroxyrédoxine 3 (Prx3) (Chae et al., 1999 ; Rhee et al., 2005 ; Brown et al., 2008)
Dès 1997, Watabe et al. avaient mis en évidence une enzyme mitochondriale réductrice du peroxyde d'hydrogène en présence de thiorédoxine, qu'ils nommèrent SP-22. Cette peroxydase fut ensuite dénommée thiorédoxine réductase (Kang et al., 1998a), puis son analogie de structure avec les nouvelles peroxydases isolées des peroxysomes la rangea parmi celles-ci et elle devint la peroxyrédoxine-3.
La famille des peroxyrédoxines (Pmp20 ou Prx), d'abord identifiée dans les peroxysomes, est un ensemble d'enzymes capables de dégrader non seulement le peroxyde d'hydrogène, mais aussi les peroxydes organiques, grâce à leur résidu cystéinyl: ce sont donc des peroxydases (Yamashita et al., 1999 ; Horiguchi et al., 2001). Ces peroxydases sont ubiquistes. Elles utilisent des résidus cystéinyls redox-actifs (Wood et al., 2003a et 2003b).
On a isolé 6 Prx dans les cellules ; elles coexistent dans diverses organelles (Chae et al., 1999 ; Kang et al., 1998a et 1998b ; Kinnula et al., 2002 ; Seo et al., 2000).
Les Prx sont séparées en 2 classes : celles qui ne contiennent qu'une cystéine et celles qui en présentent deux. La Prx-3 mitochondriale contient deux résidus Cys (Rhee et al., 2005).

Nonn et al. (2003) démontrèrent la présence d'une peroxyrédoxine-3, exclusivement mitochondriale, dont le co-facteur est la thiorédoxine-2 réduite, déjà décrite en 1997 par Watabe et al. La Prx-3 est oxydée dans la mitochondrie et sa forme oxydée est réduite par la Trx-2 en présence de la TrxR-2 (Spyrou et al., 1997; Lee et al., 1999; Chang et al., 2004). La Prx-2 et la Trx-2 sont synthétisées dans le cytosol (Spyrou et al., 1997; Lee et al., 1999; Chang et al., 2004).

La peroxyrédoxine-3 intervient dans l'apoptose régulée par les mitochondries (Chang et al., 2004). « Peroxiredoxins (Prx)2 are antioxidant enzymes that modulate the cellular response to oxidative stress, in particular to H₂O₂ » (Nemoto et Finkel, 2002 ; Rhee et al., 2005).

4. Importance du ^•NO et des nitrosations

         P-SH  + ^•NO     ⇒ P-S-NO (S-nitrosylation )

Voir chapitre III.

5. Homéostasie de l'environnement redox

Des systèmes tampons interviennent constamment pour maintenir stable l'environnement redox (Starkov et Fiskum, 2003; Aon et al., 2007).

C'est une série de couples redox, dont l'équilibre est modifié par des enzymes appropriées, qui maintient le milieu mitochondrial à un niveau très électronégatif, c'est-à-dire réducteur. On compte notamment (Schafer et Buettner, 2001) :

  1) GSH/GSSG sous la dépendance de la GSH-peroxydase et de la GS-SG réductase.
  2) NADH/NAD⁺
  3) NADPH/NADP⁺ sous la dépendance de la transhydrogénase.
  4) FADH₂/FAD dépendant de la succinodéshydrogénase.
  5) Trx(SH)₂/Trx-S-S (Damdimopoulos et al., 2002; He et al., 2008)
Ces couples assurent l'équilibre (= balance des Anglo-Saxons) dans la zone réductrice de l'échelle des potentiels redox.

Deux systèmes sont particulièrement importants dans la liste ci-dessus:
            le couple GSH/GSSG piloté par les GSH-peroxydase et GSH-réductase
            le système de la Trx-2
qui assument principalement le contrôle redox (Dröge, 2002; Fernandez-Checa, 2003; Wood et al., 2003 a et 2003b). C'est le système du GSH qui l'emporte, le glutathion étant de cent à mille fois plus abondant que la Trx-2 (Jezek et Hlavata, 2005).

6. Troubles de l'équilibre redox et activation de O₂

Pour diverses raisons, l'équilibre redox peut être amené dans une zone plus positive, donc oxydante, que normalement et on parle alors de "stress oxydant."
Dans d'autres situations, la balance redox peut devenir plus négative, plus réductrice : il y a "stress réducteur" (Shen et al., 2005).
Dans les deux cas, une activation directe de l'oxygène ou l'apparition de réactions radicalaires activatrices de l'oxygène se produiront.

A. Stress oxydant
Cette situation pathologique est produite par les ROS dont la concentration dépasse les limites à l’intérieur desquelles elles jouent un rôle physiologique.
Sur la nature de ces ROS, voir le chapitre XIV dans l’Initiation au Métabolisme de l’Oxygène.
Sur le stress oxydant dans la mitochondrie, voir les chapitres VI, VII et VIII du présent travail.

B. Stress réducteur
Il se produit lorsque l'environnement redox devient trop négatif et trouve son origine aussi bien dans le cytosol que dans les mitochondries.
L'existence d'un stress réducteur prenant son origine dans la mitochondrie a été démontrée par Niknahad et al. (1995) et par Dawson et al. (1993). Ce stress peut s'observer au cours des intoxications par les dioxines qui augmentent la production d'anion superoxyde. Il est aggravé par la libération de Fe non hémique et est atténué par l'addition de chélateurs de Fe.